### 类器官原代培养流程

#### 一、准备工作

1. 仪器设备：CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2. 试剂耗材（以肠癌为例）：动物脑类器官培养基试剂盒（abs90050）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、60mm细胞培养皿（abs7005）、100μm滤筛（abs7009）、15mL离心管（abs7102）、15mLEP管若干（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊。

**组分名称 规格**

动物脑类器官培养基 A 100mL

类器官原代培养缓冲液 B 250mL

原代组织消化液 C 30mL

类器官传代消化液 D 30mL

组织保存液 E 100mL

类器官冻存液 F 20mL

类器官传代培养缓冲液 G 250mL

#### 二、操作流程

1. 样本准备：

(1) 将组织放入含有预冷（2-8°C）组织保存液 E 的取样瓶中，确保整个组织浸没，再在 4℃ 存放，从医院或实验室取回；

(2) 消毒样本瓶，取出组织并放入培养皿中拍照并进行登记，记录大小、颜色、软硬程度及组织类型等信息。

2. 清洗-剪碎：

(1) 在 60mm 细胞培养皿（abs7005）中加 2-3mL 原代培养缓冲液 B 浸泡，然后用原代培养缓冲液 B 清洗三次（每次更换培养皿），剪成约 1-3 mm³ 的组织块并转移至 15mL 离心管。

3. 消化-过滤：

(1) 向 15mL 离心管中加入 5 倍原代组织消化液 C（体积比 5:1），在 37℃ 消化 15-30 分钟，随时观察消化情况；

(2) 当显微镜下观察到有多个细胞团（5-50 个细胞聚集）时，加入 3 倍体积的原代培养缓冲液 B 终止消化，轻柔吹打使液体浑浊；

(3) 使用 100μm 滤筛（abs7009）进行过滤，并观察滤液，收集至 15mL 离心管中，在 300g、4℃ 下离心 5 分钟，去除上清。

4. 加胶-点板-加液：

(1) 准备工作：基质胶需在金属冰盒中于 4℃ 冰箱过夜融化；枪头和离心管需在 -20℃ 预冷至少半小时；融化后的基质胶应在4℃保存，建议在两周内用完；

(2) 接种每孔需 25μL 的基质胶细胞团混合物，500-750μL 类器官培养液；

(3) 接种密度建议：基质胶体积与细胞团沉淀体积为 25:1，建议使用 300μL 基质胶；

(4) 加胶-点板：加入基质胶（abs9495）并轻柔混匀，点板操作应在金属冰盒或冰上进行，控制在半分钟内，以保持基质胶良好的流动性；

(5) 加液：将培养板放入 37℃ 培养箱中 40-60 分钟成胶，添加 500-750μL 类器官培养基 A 并培养，10-14 天后，可进行传代操作。

#### 传代与冻存

**传代步骤**：

1. 类器官收集及洗涤：移液器吸去培养基后，每孔加入 4℃ 的类器官传代培养缓冲液 G，轻柔吹散基质胶；

2. 进行离心，依据分层情况进行操作，确保类器官沉淀的有效收集；

3. 设置细胞消化、加入基质胶、点板及培养液的步骤与原代相似，根据实际情况进行适当调整。

**冻存要求**：

1. 在类器官指数增长期进行冻存，通常选择传代第 3-4 天进行操作；

2. 加入适量的类器官冻存液 F，轻柔重悬后立即进行冻存；

3. 梯度冻存至 -80℃ 并转移至液氮罐保存。

#### 复苏步骤

1. 预热水浴锅至 37℃ 并进行实验室的常规消毒；

2. 快速解冻后，移入离心管中，添加类器官传代培养缓冲液 G 重悬；

3. 加胶、点板及加液步骤同样遵循原代培养的方法，确保类器官在培养过程中活性保持。

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